Obrazowanie krzepnięcia dzięki świetlikom

Od jakiegoś czasu poszukuje się związków chemicznych wspomagających obrazowanie, które sprawdziłyby się w ramach monitoringu pacjentów zażywających heparynę, czyli lek zapobiegający krzepnięciu krwi. Wg Włochów, do tego celu świetnie nadaje się lucyferaza - enzym odpowiadający za świecenie robaczków świętojańskich (Bioconjugate Chemistry).

Zespół Bruce'a Branchiniego wskazywał na potrzebę wynalezienia takich związków wspomagających obrazowanie, które emitowałyby promieniowanie w bliskiej podczerwieni. Głębiej penetruje ono tkankę, pozwalając lekarzom wykryć białka zaangażowane w krzepnięcie.

Podczas testów naukowcy połączyli proteinę pozyskiwaną z lucyferazy świetlików z gatunku Photinis pyralis ze specjalnym fluorescencyjnym barwnikiem. Umożliwia on białku emitowanie promieniowania w bliskiej podczerwieni. Okazało się, że pozwala to wykryć niewielkie ilości aktywnego czynnika X (Xa). Inhibitory tego związku wykorzystuje się w zapobieganiu zdarzeniom zakrzepowo-zatorowym. Czynnik Xa bierze udział m.in. w aktywacji VIII czynnika krzepnięcia.

Bioluminescencja i rezonansowe przeniesienie energii wzbudzenia bioluminescencji (ang. bioluminescence resonance energy transfer, BRET) to dwa naturalnie występujące zjawiska emisji promieniowania, które wykorzystano do różnych celów, np. obrazowania in vivo. Kluczowym elementem takich aplikacji jest lucyferaza, dająca żółtozielone światło. Opisywane technologie można ulepszyć, bazując na potencjale promienowania w bliskiej podczerwieni (nIR). Włosi zademonstrowali, że da się uzyskać emisję spektralną z maksimami 705 i 783 nm, wiążąc kowalencyjnie wariant lucyferazy z fluorescencyjnym barwnikami nIR.

Akademicy zwracają uwagę na znaczenie wybiórczego znakowania fluorescencyjnymi barwnikami i skuteczność zapewnianą przez proces międzycząsteczkowego BRET. Włochom udało się też skonstruować wspomniane już wcześniej biotynylowane (oznakowane) białko fuzujące, czyli zlewające się, które emitowało promieniowanie w podczerwieni. Nowy materiał unieruchomiono na podłożu/macierzy zawierającej streptoawidynę - stosowaną w biotechnologii do oczyszczania białek - pokazując, że rozwiązanie można by uwzględnić w obrazowaniu z wykorzystaniem receptorów. To samo białko zastosowano do określenia aktywności czynnika Xa przy fizjologicznych stężeniach we krwi.

W badanym układzie emisja w podczerwieni była możliwa tylko w sytuacji, kiedy cząsteczka lucyferazy była ściśle powiązana z barwnikiem fluorescencyjnym. Autorzy studium wykorzystali to zjawisko i połączyli obie te molekuły za pomocą krótkiego łańcucha aminokwasowego podatnego na trawienie przez czynnik Xa. W tej sytuacji aktywacja czynnika X powodowała nie tylko powstawanie skrzepu, ale też rozpad kompleksu lucyferazy z fluorochromem i tym samym spadek emisji nIR w próbce. Dokładny pomiar tempa tego zaniku pozwolił tym samym na ustalenie aktywności enzymatycznej czynnika Xa.

lucyferaza obrazowanie bliska podczerwień heparyna białka czynnik krzepnięcia aktywny czynnik X Xa Bruce Branchini